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Tabla 1. Métodos diagnósticos capaces de identificar variantes estructurales
Transl
Inv
CNV (> 50 Kb)
Indel (1-50 Kb)
SV < 1 Kb
Análisis genoma
Sí (> 3 Mb)
Sí (> 3 Mb)
Sí (> 3 Mb)
No
No
No
No
Sí (> 5 Kb)
No
No
No
No
Sí
Sí
Sí (SNP)
Sí
Sí
Sí
Sí
No
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Análisis dirigido
No
No
No
Sí
Sí
No
No
No
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
Método
Sec punto ruptura
Cariotipo No aCGH No aSNP No
Sec PE
Sec Nanoporo
Sí Sí
MLPA No RT-qPCR No FISH No
aCGH: array comparative genome hybridization; aSNP: array single nucleotide polymorphism; CNV: copy number variation; FISH: fluorescence in situ hybridization; Inv: inversión; Kb: kilobase; Mb: megabase; MLPA: multiple ligation probe amplification; RT-qPCR: real time quantitative PCR; Sec PE: secuenciación paired-end; Sec: secuenciación; SV: structural variant; Trans: translocación
temas tanto dirigidos a genes específicos como que abarcan el genoma completo capaces de detectar las SV, es cierto que algunos tipos de SV (por ejemplo, inversiones o inserciones de retrotransposones) y es- pecialmente algunas localizaciones, como intrónicas o reguladoras, son muy difíciles de detectar o no se caracterizan a nivel de la secuencia con muchos de los métodos moleculares empleados rutinariamen- te(17) (Tabla 1).
Nuestro grupo ha desarrollado un proyecto que ha investigado las SV implicadas en la deficiencia de antitrombina, la trombofilia más grave. Para ello, hemos comparado diferentes metodologías mole- culares empleadas en identificar estas alteraciones, desde MLPA (multiplex ligation-dependent probe am- plification) a array de hibridación genómica compa- rada (CGHa) o PCR largas y posterior secuenciación, y, sobre todo, hemos empleado sistemas de secuen- ciación de tercera generación con nanoporos, que permiten un estudio del genoma completo sin ningu- na manipulación generando secuencias extralargas (de hasta 2,5 Mb)(18).
El estudio se ha realizado en 2 cohortes: por una parte, casos con deficiencia de este anticoagulante que tenían una SV que afecta a SERPINC1, el gen que codifica antitrombina, identificada mediante MLPA; y, por otra parte, casos en los que ni la secuenciación (NGS o Sanger) ni el MLPA identificaron alteraciones relevantes en SERPINC1. En el grupo de SV la secuen- ciación por nanoporos identificó todas las SV, inde- pendientemente de la extensión (desde 193 pb a
2 Mb) o tipo (deleción o duplicación); definió exacta- mente la extensión de la SV y estableció la secuencia exacta del punto de ruptura(19). Este último aspecto es clave en varios aspectos. Primero, ayuda a diseñar con precisión los sistemas de verificación que validen los resultados obtenidos. En segundo lugar, ayuda a definir el mecanismo implicado.
Así, en nuestros casos, la identificación en la ma- yoría de los casos de secuencias repetitivas en la cercanía del punto de ruptura y la presencia de mi- crohomología (de 3 a 30 pb) en el punto de ruptura muestran la relevancia de las secuencias repetitivas (abundantes en SERPINC1) en el desarrollo de estas SV y la implicación de un mecanismo basado en re- plicación (BIR/MMBIR/FoSTeS) que explique la apari- ción de estas SV. Pero quizás la mayor ventaja desde el punto de vista diagnóstico es que la secuencia- ción por nanoporos permite conocer la arquitectura genética general aclarando casos con un diagnos- tico incorrecto o contradictorio, o identificando nue- vos mecanismos de esta enfermedad.
De esta forma, pudimos demostrar que la supues- ta deleción del exón 1 diagnosticada por MLPA en un caso, contradictoria con el diagnóstico de de- leción de los exones 1 y 2 que sugería el análisis por LR-PCR y secuenciación, en realidad era una va- riante estructural compleja (C×SV) que implicaba una duplicación de los exones 2 y 3, con posterior deleción de los exones 1 y 2, siendo la primera C×SV identificada en la deficiencia de antitrombina(19). Pero el resultado más interesante implica los casos
LXII Congreso Nacional de la Sociedad Española de Hematología y Hemoterapia / Ponencias
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